Article Annexe de l'Arrêté du 2 septembre 1983 relatif aux méthodes officielles d'analyses relatives à la détection des antibiotiques et des sulfamides dans les laits destinés à l'alimentation humaine ou animale

7. Préparation des échantillons de lait témoin.

Des échantillons de lait témoin contenant des antibiotiques et un sulfamide de référence doivent être préparés au moment de chaque essai. Ils permettent de vérifier que les milieux de culture utilisés sont satisfaisants, et que les conditions de la manipulation, notamment la concentration, le développement, et la sensibilité du micro-organisme sont correctes.

7. 1. Echantillon de lait témoin contenant de la pénicilline.

Une solution-mère de pénicilline contenant 1 mg de pénicilline par millilitre est préparée en fiole jaugée (5. 12) en dissolvant 100 mg de pénicilline G (Benzylpénicillinate de sodium) dans 100 ml d'eau stérile. Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum.

Le jour de l'essai, préparer une dilution au 1 / 10000 de la solution-mère en effectuant deux dilutions successives au 1 / 100 dans de l'eau stérile. Ajouter 6 ml de cette dilution à 94 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1). Le lait pénicilliné obtenu contient 0, 006 micron de gramme de pénicilline par millilitre, équivalent à 0, 01 U.I. de pénicilline par millilitre.

7. 2. Echantillon de lait témoin contenant de la streptomycine.

Une solution-mère de streptomycine contenant 1 mg de streptomycine par millilitre est préparée en fiole jaugée (5. 12) en dissolvant

100 mg de sulfate de streptomycine dans 100 ml d'eau stérile. Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum.

Le jour de l'essai, préparer une dilution au 1 / 100 de la solution-mère dans de l'eau stérile. Ajouter 5 ml de cette dilution à 95 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1). Le lait ainsi préparé contient 0, 5 micron de gramme de streptomycine par millilitre.

7. 3. Echantillon de lait témoin contenant du chloramphénicol.

Une solution-mère de chloramphénicol contenant 1 mg de chloramphénicol par millilitre est préparée en fiole jaugée (5. 12) en dissolvant 100 mg de chloramphénicol dans 100 ml d'eau stérile.

Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum.

Le jour de l'essai, préparer une dilution au 1 / 10 de la solution-mère dans de l'eau stérile. Ajouter 2, 5 ml de cette dilution à 97, 5 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1). Le lait ainsi préparé contient 2, 5 microns de gramme de chloramphénicol par millilitre.

7. 4. Echantillon de lait témoin contenant du sulfathiazol.

Une solution-mère de sulfathiazol contenant 1 mg de sulfathiazol par millilitre est préparée en fiole jaugée (5. 12) en dissolvant 100 mg de sulfathiazol (sel de sodium) dans 100 ml d'eau stérile. Cette solution est conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) et peut être utilisée pendant deux semaines au maximum.

Le jour de l'essai, préparer une dilution au 1 / 10 de la solution mère dans de l'eau stérile. Ajouter 1 ml de cette dilution à 99 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1). Le lait ainsi préparé contient 1 micron de gramme de sulfathiazol par millilitre.

8. Préparation de l'échantillon de lait en vue de l'examen.

Selon le type de lait examiné, la détection des antibiotiques et des sulfamides peut s'effectuer d'une manière directe ou après une préparation de l'échantillon.

8. 1. Type de lait ne nécessitant aucune préparation : lait cru, lait pasteurisé, lait stérilisé et lait stérilisé U.H.T..

Dans le cas où l'échantillon de lait cru ou de lait pasteurisé est conservé à-25 degrés C ou au voisinage de 0 degré C, le décongeler ou le réchauffer en le plaçant dans un bain d'eau à 40 degrés C.

8. 2. Type de lait nécessitant une préparation.

8. 2. 1. Lait totalement déshydraté : lait en poudre.

Les épreuves de détection sont appliquées sur une solution à 10 %, obtenue par l'introduction de 5 grammes de lait en poudre dans 45 ml d'eau stérile préchauffée à 45 degrés C. La dissolution est réalisée par agitation manuelle ou électromagnétique à l'aide de l'appareil (5. 7). La solution de lait doit être exempte de grumeaux.

8. 2. 2. Lait partiellement déshydraté : lait concentré sucré, lait concentré non sucré (stérilisé ou pasteurisé).

Les épreuves de détection sont appliquées sur une solution de lait obtenue après dilution à la concentration du lait initial.

9. Mode opératoire.

9. 1. Méthode d'acidification.

Cette méthode est applicable à tous les types de lait mentionnés au domaine d'application excepté le lait concentré sucré.

Elle est inapplicable lorsque le lait est acide et coagule à l'ébullition.

9. 1. 1. Traitement préalable de l'échantillon et du lait témoin contenant de la pénicilline.

Pour la préparation de l'échantillon, si nécessaire, se référer au paragraphe 8.

Agiter l'échantillon de lait à examiner de façon à bien mélanger éventuellement la crème avec le lait.

Introduire 2 ml de lait dans un tube stérile de 16 X 160 ml (5. 13), en prenant soin de ne pas mouiller les parois du tube.

Placer le tube dans un bain d'eau à 100 degrés C (5. 3) pendant cinq minutes, le niveau du lait étant au moins à 2 cm au-dessous de celui de l'eau. Refroidir à 45 degrés C (5. 4).

Préparer un tube témoin négatif avec 2 ml de lait reconstitué selon la formule donnée en (4. 2. 1) et un tube témoin positif avec 2 ml de lait contenant 0, 01 U.I. / ml de pénicilline (7.1) et soumettre ces tubes aux conditions de chauffage indiquées ci-dessus.

9. 1. 2. Technique d'acidification.

Introduire ensuite dans chaque tube 0, 1 ml de la culture d'épreuve (6. 1. 2) et 0, 2 ml de la solution de triméthoprime (4. 2. 4).

Placer tous les tubes dans un bain d'eau à 45 plus ou moins 0, 5 degré C pendant deux heures trente minutes.

A la fin de cette période d'incubation, le tube témoin négatif doit être jaune et le tube témoin positif, contenant 0, 01 U.I. / ml de pénicilline, bleu.

9. 2. Méthodes de confirmation.

Les trois méthodes de diffusion en gélose à l'aide de Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis et Bacillus megaterium sont applicables à tous les types de lait mentionnés au domaine d'application.

Elles sont inapplicables lorsque le lait est acide et coagule à l'ébullition.

9. 2. 1. Traitement préalable de l'échantillon.

Pour la préparation de l'échantillon, si nécessaire, se référer au paragraphe 8.

Agiter l'échantillon de lait à examiner de façon à bien mélanger éventuellement la crème avec le lait.

9. 2. 1. 1. Lait cru.

Introduire 2 ml de lait dans un tube de 16 X 160 mm (5. 13) stérile, en prenant soin de ne pas mouiller les parois du tube. Placer dans un bain d'eau réglé à 80 degrés C (5. 3) pendant dix minutes, le niveau de lait étant au moins à 2 cm au-dessous de celui de l'eau. Refroidir à la température ambiante.

9. 2. 1. 2. Lait traité thermiquement, lait partiellement ou totalement déshydraté.

Ces divers types de lait ne sont pas soumis au chauffage à 80 degrés C.

9. 2. 2. Technique de diffusion.

Prélever au moyen d'une pince (5. 21) flambée un disque de papier filtre stérile de 9 mm de diamètre (5. 19). Mettre en contact le bord du disque avec la surface de lait jusqu'à ce que le disque soit complètement imprégné de lait.L'excès de lait est éventuellement éliminé en égouttant le disque contre la paroi du tube. Déposer ensuite le disque sur une feuille de papier filtre stérile (5. 20), le retourner puis, à l'aide de la pince, le déposer à plat à la surface du milieu gélosé en pressant légèrement.

Cette opération est pratiquée sur une boîte de Petri préparée selon 6. 2. 1. 4, 6. 2. 2. 3 et 6. 2. 3. 4.

De manière identique, déposer dans chacune de ces boîtes six disques correspondant aux échantillons de lait à examiner et un disque imprégné de lait témoin contenant l'antibiotique ou le sulfamide (cf. 9. 2. 2. 1, 9. 2. 2. 2. et 9. 2. 2. 3).

Ces laits témoins ne sont pas soumis au chauffage à 80 degrés C.

Tous les disques doivent se situer sur un cercle à 1 cm de la périphérie de la boîte. Aucun disque ne doit être placé au centre de la boîte.

Appliquer ce mode opératoire aux trois épreuves de diffusion en respectant les indications suivantes :

9. 2. 2. 1. Bacillus stearothermophilus.

Utiliser les boîtes de Petri préparées en 6. 2. 1. 4.

Déposer un disque imprégné de lait témoin contenant de la pénicilline (7. 1).

Les boîtes ainsi préparées sont placées, couvercle en dessous, dans une étuve à 55 plus ou moins 1 degré C pendant deux heures et demie.A l'issue de l'incubation, le disque imprégné de lait témoin contenant à 0, 01 U.I. de pénicilline par ml doit présenter une zone d'inhibition nette, d'environ 12 mm de diamètre.

9. 2. 2. 2. Bacillus subtilis.

Utiliser les boîtes de Petri préparées en 6. 2. 2. 3.

Déposer un disque imprégné de lait témoin contenant de la streptomycine (7. 2).

Les boîtes ainsi préparées sont placées, couvercle en dessous, dans une étuve à 30 plus ou moins 1 degré C pendant seize à dix-huit heures.A l'issue de l'incubation, le disque imprégné de lait témoin contenant 0, 5 micron de gramme de streptomycine par ml doit présenter une zone d'inhibition nette, d'environ 12 mm de diamètre.

9. 2. 2. 3. Bacillus megaterium.

Utiliser les boîtes de Petri préparées en 6. 2. 3. 4.

Déposer un disque imprégné de lait témoin contenant du chloramphénicol (7. 3) et un disque imprégné de lait témoin contenant du sulfathiazol (7. 4).

Les boîtes ainsi préparées sont placées, couvercle en dessous, dans une étuve à 37 plus ou moins 1 degré C pendant cinq heures.A l'issue de l'incubation, les disques imprégnés de lait témoin contenant 2, 5 microns de gramme de chloramphénicol par ml et de lait témoin contenant 1 micron de gramme de sulfathiazol par ml doivent présenter des zones d'inhibition nettes d'environ 12 mm de diamètre.

10. Expression des résultats.

10. 1. Méthode d'acidification à l'aide de Streptococcus thermophilus.

Si le lait examiné est jaune, le résultat est considéré comme négatif.

Si le lait examiné est bleu, le résultat est considéré comme positif.

Si le lait présente une coloration intermédiaire entre celle du témoin positif (bleue) et celle du témoin négatif (jaune), le résultat est considéré comme douteux. En présence de ces deux dernières réactions, l'échantillon doit être soumis le plus rapidement possible aux trois épreuves de confirmation.

10. 2. Méthodes de confirmation.

10. 2. 1. Technique de diffusion en gélose à l'aide de Bacillus stearothermophilus.

Sont considérés comme positifs les échantillons de lait donnant des zones d'inhibition d'au moins 10 mm de diamètre.

Cette technique permet de détecter plus particulièrement les pénicillines et les tétracyclines.

10. 2. 2. Technique de diffusion en gélose à l'aide de Bacillus subtilis.

Sont considérés comme positifs les échantillons de lait donnant des zones d'inhibition d'au moins 10 mm de diamètre.

Cette technique permet de détecter plus particulièrement les aminosides (streptomycine, néomycine, kanamycine, etc.) et les macrolides (érythromycine, spiramycine, etc.).

10. 2. 3. Technique de diffusion en gélose à l'aide de Bacillus megaterium.

Sont considérés comme positifs les échantillons de lait donnant des zones d'inhibition d'au moins 10 mm de diamètre.

Cette technique permet de détecter un certain nombre de sulfamides et d'antibiotiques, en particulier le chloramphénicol.

10. 3. Conclusion.

Sont considérés comme contenant des antibiotiques et / ou des sulfamides les échantillons de lait trouvés positifs par l'une au moins des techniques de diffusion en gélose.