Arrêté du 20 octobre 1985 relatif à la méthode de dosage de l'aflatoxine M1 dans les laits

Les laboratoires chargés de concourir à l'application de la réglementation relative à la répression des fraudes sont tenus d'employer, pour le dosage de l'aflatoxine M1 dans les laits, la méthode d'analyse décrite en annexe du présent arrêté.

Le directeur de la consommation et de la répression des fraudes est chargé de l'exécution du présent arrêté, qui sera publié au Journal officiel de la République française.

I - Objet.
La méthode permet d'extraire, de séparer et de doser l'aflatoxine M1 dans les laits.
II - Principe.
Après dénaturation des caséines du lait par ajustement du pH au point isoélectrique, puis addition de méthanol, l'aflatoxine M1 est extraite de la phase hydrométhanolique par le dichlorométhane à l'aide d'une colonne Extrelut, prête à l'emploi. Elle est ensuite déposée sur une plaque de silice, purifiée in situ par lavage à l'oxyde diéthylique, isolée par chromatographie unidimensionnelle et dosée, in situ également, par détection fluorimétrique.
Il est possible d'effectuer dix dosages sur une seule plaque avec un seuil de détection de 0,1 ng permettant de déceler une pollution de 10 ppt.
III - Réactifs.
Les réactifs doivent être de qualité analytique et l'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de pureté au moins équivalente.
3.1. Méthanol.
3.2. Dichlorométhane.
3.3. Chloroforme stabilisé par 1 p. 100 d'éthanol.
3.4. Chloroforme stabilisé par du méthyl-2-butène-2.
3.5. Solution acide chlorhydrique-eau (1 + 3 ; v/v).
3.6. Aflatoxine M1 cristallisée 10 microns de g.
3.7. Solution étalon d'aflatoxine M1 à 0,1 micron de g/ml dans le chloroforme (3.4).
3.8. Solution acide sulfurique-eau (5 + 95 ; v/v).
3.9. Solvants de développement :
3.9.1. Oxyde diéthylique ;
3.9.2. Mélange acétone-oxyde diéthylique (1 + 9 ; v/v).
IV - Appareillage.
Matériel courant de laboratoire et notamment :
4.1. Appareil rotatif à évaporation sous vide avec ballon à fond rond de 500 ml en verrerie inactinique.
4.2. Appareillage de dépôt automatique pour l'application quantitative d'échantillons en chromatographie couche mince (C.C.M.), Linomatt III Camag ou équivalent.
4.3. Chambre Vario-KS Camag ou équivalent, équipée du plateau de conditionnement à cinq compartiments, de la tôle "sandwich" et de l'augette à solvant à un compartiment munie d'une mèche (4.15).
4.4. Etuve cryothermique à culture type KLT2 Ehret ou équivalent.
4.5. Lampes U.V. à ondes longues (366 nm) équipée de deux tubes de 8 watts et d'un filtre sélectif, combinée au boîtier d'observation U.V. Camag ou équivalent.
4.6. Photodensitomètre automatique avec monochromateur Scanner C.C.M./C.C.M. HP Camag ou équivalent.
4.7. Guide universel Camag ou équivalent.
4.8. Grattoir Camag ou équivalent.
4.9. Plaques de gel de silice Merck 60 (sans indicateur de fluorescence) prêtes à la C.C.M., dimensions 20 x 20 cm, épaisseur 0,25 mm.
4.10. Colonnes prêtes à l'emploi Extrelut Merck.
4.11. Tubes coniques bouchés émeri de 5 ml gradués au 1/10e de ml, en verrerie inactinique.
4.12. Agitateur magnétique.
4.13. pH mètre à électrode de référence séparée.
4.14. Filtres plissés Durieux pur chiffon 2 B ou équivalent.
4.15. Mèches de transmission de solvant Camag ou équivalent.
4.16. Bécher de 100 ml en verrerie inactinique.
4.17. Seringue de 100 microns de l pour Linomatt III Camag.
4.18. Seringue de 50 micron de l.
4.19. Seringue de 1 ml.
4.20. Flacon operculé type "pénicilline" en verrerie inactinique.
V - Mode opératoire.
5.1. Préparation et contrôle de la solution étalon d'aflatoxine M1 (3.7) :
5.1.1. Préparation de la solution mère et détermination de sa concentration.
Préparer une solution d'aflatoxine M1 en introduisant 1 ml de chloroforme (3.4) à l'aide de la seringue (4.19) dans le flacon operculé d'aflatoxine M1 (3.6).
Déterminer son spectre d'absorption entre 330 et 370 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre U.V. par rapport au chloroforme (3.4) et noter le maximum d'absorbance (A) qui est proche de 350 nm.
Calculer la concentration en aflatoxine M1, en microns de g/ml de solution à l'aide de la formule suivante :
328. A. 1.000 / 19.950
5.1.2. Dilution.
Effectuer à l'abri de la lumière la dilution à 0,1 microns de g/ml en prélevant à l'aide de la seringue (4.18) 50 microns de l de solution mère qui sont introduits dans un flacon operculé (4.20) contenant 4,950 ml de chloroforme (3.4). Cette solution doit être conservée au congélateur à - 18° C et renouvelée tous les quinze jours.
Note très importante :
L'Aflatoxine M1 est d'une manipulation très dangereuse, il est obligatoire de prendre toutes les précautions (port de gants, travail sous hotte ...) nécessaires lors de son utilisation.
5.2. Extraction.
Pipeter 50,00 ml de lait liquide ou sec reconstitué dans un bécher (4.16).
Ajuster le pH à 4,6 plus ou moins 0,05 sous agitation magnétique à l'aide de la solution d'acide chlorhydrique (3.5).
Ajouter 30 ml de méthanol (3.1) (une partie de ce méthanol servira au rinçage des électrodes) recouvrir le bécher d'un verre de montre et maintenir l'agitation magnétique pendant 15 minutes. Pour obtenir un filtrat limpide, refroidir à environ 4° C puis filtrer sur filtre plissé (4.14).
Introduire 20 ml du filtrat au sommet de la colonne Extrelut (4.10). Laisser l'échantillon se répartir sur la matrice poreuse pendant 15 minutes.
Eluer la fraction contenant la toxine par 200 ml de dichlorométhane (3.2). Recueillir la totalité de l'éluat dans le ballon de l'évaporateur rotatif (4.1). L'évaporer avec précaution sous vide à une température de 35° C jusqu'à un volume de 1 ml environ (au cours de cette opération, il faut éviter d'aller jusqu'à la siccité). Transférer quantitativement le volume résiduel à l'aide du chloroforme (3.3) dans le tube conique bouché émeri de 5 ml (4.11). L'amener quantitativement à moins de 100 microns de l (environ 70 microns de l) sous un léger courant de gaz inerte en plongeant le tube dans un bain d'eau ne dépassant pas 55° C.
5.3. Préparation de la plaque.
Placer la plaque dans le guide universel Camag (4.7) et la dégarnir comme indiqué sur la figure 1, sur une largeur de 15 mm sur deux côtés parallèles et selon un trait horizontal de 2 mm de large à 10 cm de la ligne des dépôts pour limiter le mouvement du solvant.
5.4. Dépôts.
Pendant la réalisation des dépôts et au cours des étapes suivantes, la couche mince doit être protégée de la lumière.
A 2 cm du bord inférieur de la plaque préparée en 5.3, déposer à l'aide du Linomatt III (4.2) 10, 20 et 30 microns de l de la solution étalon d'aflatoxine M1 (3.7) sous forme de traits de 1 cm de long. Ces dépôts de 1, 2 et 3 nanogrammes d'aflatoxine M1 serviront à l'établissement de la courbe d'étalonnage. Prélever dans la seringue du Linomatt III (4.17) la totalité de l'extrait contenu dans le tube conique (4.11). Mesurer ce volume. Si ce volume est de 70 microns de l par exemple, introduire dans le tube 30 microns de l de chloroforme (3.3) à l'aide de la seringue (4.18) puis rincer les parois intérieures du tube en l'inclinant et en tournant. Boucher le tube et le laisser reposer cinq minutes, de façon à récupérer la presque totalité du liquide de rinçage. Prélever celui-ci à son tour dans la seringue du Linomatt III. Le volume total d'envrion 100 microns de l contient la totalité de la quantité d'aflatoxine M1 extraite.
Déposer dans les mêmes conditions que pour la solution étalon d'aflatoxine M1, la totalité de l'extrait de chaque échantillon. En espaçant les dépôts d'un millimètre, il est possible de déposer dix échantillons différents à côté des trois points de gamme comme le montre la figure 1.
5.5. Conditionnement de la couche mince.
Cette opération a pour but de contrôler l'activité de la couche mince. Pour l'effectuer, se reporter aux figures 1, 2, 3, 4 et 5. Plier la mèche (a) dans l'augette à solvant vide (b) en respectant rigoureusement le modèle de la figure 2. Placer la plaque (c), la couche dirigée vers le bas, sur le corps (d) de la chambre Vario-KS dans lequel on a mis le plateau de conditionnement à cinq compartiments (e) rempli avec 100 ml du mélange acide sulfurique-eau (3.8).
Placer la plaque afin de faire coïncider les points A et A', B et B', des figures 1 et 3. La plaque doit toucher le couvercle (f) qui ferme l'augette à solvant (b). Pendant le conditionnement la plaque est maintenue sur son support par un dispositif de serrage (g) ; la paroi mobile (h) sera relevée pour réaliser l'étanchéité du système. La couche mince est soumise pendant exactement vingt-cinq minutes à l'atmosphère du mélange acide sulfurique-eau (3.8).
Ouvrir alors le dispositif de serrage (g) et introduire jusqu'à la butée (i) la tôle "sandwich" (j), bordures dirigées vers le haut entre la plaque et le plateau de conditionnement ; fermer le dispositif de serrage (g), on réalise ainsi une cuve d'un millimètre d'épaisseur.
5.6. Purification par chromatographie sur couche mince.
Remplir avec 30 ml d'oxyde diéthylique (3.9.1) l'augette (b), amener la mèche en contact avec la couche mince au moyen du levier. La chromatographie débute, elle est terminée lorsque le solvant a atteint le trait de séparation limitant la distance de migration. Il convient de réguler la température de la cuve aux environs de 12° C, à l'aide d'une étuve cryothermique ou de tout autre moyen adapté, de telle sorte que le développement s'effectue en vingt minutes. Retirer la plaque et la laisser sécher cinq minutes exactement sous une hotte à température ambiante et à l'abri de la lumière, de façon à effectuer l'étape suivante sans avoir à reconditionner la couche mince.
5.7. Séparation de l'aflatoxine par chromatographie sur couche mince.
Changer la mèche, sécher l'augette (b) et la remplir à nouveau avec 30 ml du mélange de solvants acétone-oxyde diéthylique (3.9.2). Placer la plaque afin de faire coïncider les points A et A', B et B' des figures 1 et 3 et procéder à la chromatographie dans des conditions identiques à celles utilisées pour la purification en 5.6. Lorsque le développement est terminé, retirer la plaque, la laisser sécher cinq minutes sous une hotte à température ambiante et à l'abri de la lumière, l'examiner sous la lampe U.V. à 366 nm à une distance de 10 cm. Les bandes d'aflatoxine M1 donnent une fluorescence violette à un Rf de 0,25.
Procéder de suite à leur dosage.
Remarque : les bandes d'aflatoxine M2 donnent également une fluorescence violette à un Rf de 0,20. La présente méthode permet d'extraire, de séparer et de doser l'aflatoxine M2 dans les laits fortement contaminés.
5.8. Dosage par fluorodensitométrie.
Mesurer l'intensité de fluorescence des taches d'aflatoxine M1 à l'aide du photodensitomètre (4.6) équipé d'une lampe au mercure haute pression, d'un monochromateur de 10 nm de bande passante, avec une longueur d'onde d'excitation de 365 nm et un filtre passe haut de 405 nm.
Tracer la courbe d'étalonnage en reportant la surface des pics observés en fonction des quantités d'aflatoxine M1. La courbe est linéaire et passe par l'origine. En déduire la quantité d'aflatoxine M1 contenue dans les dépôts des extraits.
5.9. Mode de calcul et formule.
La concentration d'aflatoxine M1 exprimée en ng/litre de lait liquide ou sec reconstitué est donnée par la formule : S x 80
dans laquelle S est la quantité en nanogrammes d'aflatoxine M1 contenue dans le dépôt de l'extrait.
5.10. Taux de récupération.
Pipeter 50,00 ml de lait liquide ou sec reconstitué dans un bécher (4.16). Procéder à l'ajout d'une quantité d'aflatoxine M1 identique à celle trouvée, en utilisant la solution étalon d'aflatoxine M1 (3.7). Recouvrir le bécher d'un verre de montre. Soumettre le lait à une agitation magnétique durant dix minutes, puis ajuster le pH et continuer comme précédemment.
Pour une pollution de 10 ppt le taux de récupération est de 70 p. 100 plus ou moins 10. Il est donc indispensable de déterminer sur chaque lait le taux de récupération et de corriger le résultat en conséquence.
5.11. Test de confirmation.
La nature de la bande fluorescente d'aflatoxine M1 peut être confirmée par la technique de Van Egmond et collaborateurs parue dans J.A.O.A.C. 61 (1978) 809.812.
(Figures non reproduites, voir au JORF du 28 novembre 1985).